Улучшенные редакторы оснований цитозина, созданные на основе вариантов TadA.

Природная биотехнология, том 41, страницы 686–697 (2023 г.) Процитировать эту статью

12 тысяч доступов

4 цитаты

50 Альтметрика

Подробности о метриках

Редакторы оснований цитозина (CBE) позволяют программировать геномные мутации перехода C·G-T·A и обычно включают модифицированный фермент CRISPR-Cas, естественную цитидиндезаминазу и ингибитор репарации урацила. Предыдущие исследования показали, что CBE, использующие встречающиеся в природе цитидиндезаминазы, могут вызывать неуправляемое дезаминирование цитозина по всему геному. Хотя впоследствии сообщалось об улучшенных CBE, которые уменьшают стохастические отклонения от цели по всему геному, эти редакторы могут страдать от неоптимальной производительности при попадании на цель. Здесь мы сообщаем о создании и характеристике CBE, которые используют сконструированные варианты TadA (CBE-T), которые обеспечивают высокую направленность C·G к T·A через набор геномных локусов с разнообразной последовательностью, демонстрируют надежную активность в первичных клетках. и не вызывают заметного увеличения полногеномных мутаций. Кроме того, мы сообщаем о редакторах оснований цитозина и аденина (CABE), катализирующих редактирование как A-to-I, так и C-to-U (CABE-Ts). Вместе с ABE, CBE-T и CABE-T позволяют программировать установку всех переходных мутаций с использованием разработанных в лаборатории вариантов TadA с улучшенными свойствами по сравнению с ранее описанными CBE.

Редакторы оснований цитозина (CBE) представляют собой ферменты, редактирующие гены, способные программно вводить изменения пары оснований C·G в T·A в геномную ДНК живых клеток. Это химическое преобразование достигается посредством ферментативно-опосредованного гидролитического дезаминирования цитозина до урацила, который ДНК-полимеразы интерпретируют как тимин1. На сегодняшний день CBE обычно состоят из четырех отдельных компонентов: встречающейся в природе цитидиндезаминазы (такой как APOBEC, AID или CDA)2, нарушенной формы Cas9, способной разрывать цепь ДНК, не редактируемую основанием, одной или нескольких единиц. пептида ингибитора урацилгликозилазы (UGI) и последовательности ядерной локализации (NLS)1,2,3. Эти компоненты обычно соединены ковалентно, но могут быть собраны и нековалентно4. CBE широко используются для реверсии генов и клеточной инженерии и имеют потенциал для оказания терапевтической пользы пациентам, живущим с изнурительными генетическими заболеваниями или злокачественными новообразованиями5.

Хотя высокая эффективность целевого редактирования ДНК может быть достигнута с помощью современных инструментов базового редактирования CBE2, они также могут вызывать общегеномное, стохастическое, независимое от направляющей РНК (гРНК) нецелевое редактирование6,7. Сообщается, что редакторы CBE следующего поколения, такие как YE1 (ссылка 8), BE4-PpAPOBEC9 и другие10, смягчают независимые от гРНК нецелевые эффекты, но эти редакторы используют природные или легко сконструированные варианты деаминазы APOBEC и могут страдать от снижения -целевая производительность редактирования2,9. Кроме того, в некоторых контекстах, специфичных для последовательности, CBE на основе APOBEC могут приводить к проксимальному редактированию рядом с целевой геномной последовательностью из-за неэффективной, но измеримой способности APOBEC принимать двухцепочечную ДНК (дцДНК) в качестве субстрата11.

Редакторы адениновых оснований (ABE) представляют собой ферменты, редактирующие гены, которые программно устанавливают точечные мутации от A·T до G·C в целевых локусах с помощью разработанной в лаборатории деаминазы TadA, которая химически превращает аденин в инозин12. Пары оснований инозина с цитозином в активном центре ДНК-полимеразы приводят к мутации инозина в гуанин после репликации ДНК. Примечательно, что ABE вызывают независящие от гРНК отклонения от мишеней от низкого уровня до их отсутствия и редактируют геномную ДНК (гДНК) в более точном окне (позиции ~ 3–8, PAM 21–23), что может привести к меньшему количеству зависимых от направляющих отклонений от мишеней, поскольку а также меньшее количество правок со стороны сторонних наблюдателей по сравнению с CBE6,13. Кроме того, не сообщалось о воздействии ABE на дцДНК.

Чтобы придать CBE благоприятные свойства ABE, мы предполагали превратить TadA в фермент, способный к надежному дезаминированию цитидина, и впоследствии создали улучшенный класс CBE, который использует TadA вместо встречающейся в природе цитидиндезаминазы. Обнадеживает то, что предыдущие исследования продемонстрировали способность ABE к низкому, но обнаруживаемому редактированию C в T за счет включения UGI14. Действительно, благодаря структурно-ориентированному дизайну сообщалось о варианте ABE, ABE-P48R-UGI, который обеспечивает повышенную активность цитозина по сравнению с ABE7.10, но с высокой специфичностью последовательности TC15. Хотя эти достижения представляют собой прогресс в достижении наших целей, мы признали, что для достижения терапевтически значимой эффективности редактирования C·G в T·A с высокой чистотой продукта и без ограничений последовательности субстрата потребуются дальнейшие разработки и развитие TadA.